循环肿瘤细胞在非小细胞肺癌中的研究进展

实用医学杂志2019年第35卷第11期TheJournalofPracticalMedicine2019Vol.35No.11

·专题笔谈：肺癌·

循环肿瘤细胞在非小细胞肺癌中的研究进展

田程1

许新华2

1

三峡大学第一临床医学院（湖北宜昌443003）；2

三峡大学肿瘤研究所/宜昌市中心人民医院肿瘤科（湖北

宜昌443003）

许新华,现任三峡大学第一临床医学院肿瘤科主任、教授、主任医师、三峡大学肿瘤研究所副所长、三峡大学肿瘤防治中心副主任。从事肿瘤专业30余年,荣获宜昌市“优秀市管专家”、宜昌市卫生系统“高层次专业技术拔尖人才”，宜昌市中心人民医院“高层次专业技术拔尖人才”。国际肺癌研究协会（IASLC）会员;亚太医学生物免疫学会常委;湖北省医学生物免疫学会副理事长;湖北省临床肿瘤学会（ESCO）副理事长;湖北省医学会肿瘤学会常委;湖北省抗癌协会常务理事;湖北省医师协会肿瘤医师分会常委;湖北省抗癌协会鼻咽癌专业委员会副主任委员;湖北省抗癌协会肿瘤放射治疗专业委员会常委;湖北省抗癌协会肺癌专业委员会常委;湖北省慈善总会肿瘤救助基金专家指导委员会常委9项，发表中文核心及;宜昌市医学会肿瘤学会主任委员。承担和参与多项国家和省级课题SCI论文60余篇，具有丰富的临床科研经验。

【摘要】循环肿瘤细胞（CTCs）检测作为一种重要的液体活检技术，其检测方法近年来取得了新的发

展，同时CTCs在非小细胞肺癌（NSCLC）的诊断、疗效评价、治疗决策、转移或复发的监测等方面也被证明有着重要的价值。本文就近年来国内外的CTCs检测技术及其在NSCLC中的临床应用进展进行综述。

【关键词】循环肿瘤细胞；非小细胞肺癌；检测技术；临床应用

循环肿瘤细胞（circulatingtumorcells，CTCs）指自发或结因诊疗操作脱离原发灶或者转移灶的具有高活力、高转移潜能，进入外周血液循环的一类肿瘤细胞［1］。有研究表CellSearch直肠癌患者预后相关，揭示CTC明［2］，CTCs是肿瘤转移的主要途径，也是肿瘤筛查、诊断、search系统作为唯一用于临床检测的CTCs潜力后，FDA批准

先用上皮细胞黏附分子系统是一种基于磁免疫和染色的免疫细胞化学法，的技术。Cell⁃预后、疗效评估的重要标志物。此外，也有学者表明［2-3］CTCs，CAM（epithelial首胞，将分离的肿瘤细胞固定并用荧光抗体染色的角蛋白鉴）抗体磁珠富集CTCs，并在强力磁场下从血液中提取细celladhesionmolecule，Ep⁃的基因型和分子特征有助于分析与治疗相关的靶基因，可以反映肿瘤细胞在特定疾病阶段的异质性，CTCs识定，然后用半自动四色荧光显微镜细胞检测分析仪进行分别具有潜在治疗意义的新靶点分子，或发现潜在治疗耐药机析，最后把CKs阳性和CD45阴性的有肿瘤细胞学特征的上皮

制［4］。目前非小细胞肺癌（non⁃smallcelllungcancer，NSCLC）细胞被定义为CTCs［11］

。由于起源于上皮细胞的绝大多数肺仍然是全世界发病率及病死率最高的恶性肿瘤［5］，同时也是癌都表达EpCAM，因此可以使用CTC、CXC和Profile试剂盒，免疫治疗及靶向治疗靶点基因最多的恶性肿瘤［6］。因此，可利用与铁水结合的抗EpCAM抗体来检测CTC，这种方法优

将CTCs作为肿瘤组织标本之外的实时样本进行生物学特性于单纯使用［12］

研究，为NSCLC精准个体治疗提供指导。

1CTCs的捕获方法研究

cellONSTENKEpCAM等抗原富集CTC的技术。

［13］将黑素瘤富adhesionmolecule，MCAM）联合细胞黏附分子（melanomaCTCs检测涉及两方面的技术问题［7］CTCs，一是如何识别CAM集标记物以提高测标记物的CTC检出率为CTC检测率，18%研究显示单纯使用EpCAM作为细胞搜索，MCAMEp⁃CTCs，二是如何从外周血中分离出来，目前在临床运用的1.1捕获技术大致有如下几种。

MCAMCTC平，但MCAM联合的检出率则为EpCAM25%，证实在Cellsearch联合系统中使用EpCAM检阳性CTCs作为富集标记提高了在局限性或转移性恶性肿瘤治疗CTCs的检测水COHENCellsearch等系统根据HAYES等［8］、DANILA等［9］、［10］的试验证实CTC计数与乳腺癌、前列腺癌及

过程中的变化是否与临床结果相关，需要进一步研究。此

外，SOLER等［14］

指出，虽然Cellsearch系统被认为是目前较标准的检测方法，但其灵敏性仍有待提高，同时需要进一doi步开展临床研究以证实其在NSCLC中的临床应用价值。基金项目：：10.3969/j.issn.1006⁃5725.2019.11.003

湖北省自然科学基金计划项目（编号：2011CDB330，

1.2PT⁃PCR检测法PT⁃PCR检测法通过检测外周血中2014CFB312特异mRNA来间接检测CTCs，因为CTCs中存在某些只表通信作者：）；湖北省卫生厅科研项目许新华

E⁃mail：xuxinhua@medmail.com.cn

（编号：JX4B52）

达或高表达于肿瘤细胞而不表达于正常外周血细胞的特

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异性mRNA，因此可以作为特异性标记物识别CTCs［15］TEWES等。2.1CTCs捕获在诊断中的应用CTCs检测对于肺癌的［16］及AKTAS等［17］等研究证实利用RT⁃PCR技术早期诊断有一定优势。有研究表明，当影像学可探测的结

可高灵敏检测出CTCs并评估转移性乳腺癌和卵巢癌的患节性病变癌症病灶直径>1cm时［28］

，肺癌患者外周血液中已经

者预后。与CellSearch系统等利用免疫抗原的检测方法相可以检测到CTCs［29］

。肺癌的诊断及分期对治疗至关重要，比，PT⁃PCRPT⁃PCR检测CTC的敏感性相对较高。除了筛查CTCs是提高总体生存率的关键，而精准诊断则为个体化治疗提供了基础。目前临床主要通过组织活检明确肿瘤的基因突后通过PCRPCR法还能进一步将特异性的扩增，RNA逆转录为cDNA，随，变类型，但有研究显示，CTCs有助于明确肺癌原发病灶的

基因表型状况，有利于提高肺癌诊断的精准性［4，30］

量较少，检测法具有高特异性、以进一步进行基因表型分析。因此但该方法的不足之处是干扰基因过多、定量的优点，而且需要的样本PT⁃假阳性率高及难以保持反应的稳定性。

CHETTI1.3ISET检测法该方法在2000年由VONA等［18］提出，CTCs等。MAR⁃［31］等对其利用CTCs与正常细胞大小的差异，用8μm孔径的滤CTCs上表达水平分析比较，EGFR基因在晚期肺癌组织及其外周血术的不断优化，表达水平具有一致性。因此，发现EGFR敏感度和特异性不断提高，随着近年基因在活检组织与其有望成为肺CTCs检测技膜筛出预先固定的外周血后，再将循环肿瘤细胞免疫染色癌早期分子诊断的有益方法及技术［32］。

后LECHARPENTIER进行CTCs计数等及观察分析细胞的形态特征［19］。2.2CTCs检测在肺癌疗效评价中的应用手术、化疗、［20］采用ISET富集CTCs，首次在非小靶向治疗、免疫治疗是目前肺癌主要的治疗手段，在疾病细胞肺癌患者外周血中发现同时具有上皮和间质表型的进展或出现转移复发之前能否进行有效评价是至关重要混MAZZINI合CTC，进一步揭示EMT的意义以及转移的机制的。BAYARRI⁃LARA等［33］等前瞻性地分析了56例NSCLCCTCs等。［21］通过ISET对31例葡萄膜黑色素瘤患者进行患者手术前和术后1个月的CTCs计数，术前每10mL外周血中平均有3.16个CTCs，术后降低至0.66个，且发现术后簇，证实检测，CTC并在有作为葡萄膜黑色素瘤患者预后不良标志物17例患者中检测出单个CTC或CTC细胞持续存在的CTCs提示着肿瘤的早期复发（P=0.018）和较的作用。ISET优点是它能在不破坏细胞形态的情况下分离短的无进展生存期（P=0.008），反映了CTCs评估肺癌患上皮细胞，这一特性与它的高敏感性有关。因此ISET广泛者术后复发风险的价值。此外，CTCs在实时监测肿瘤耐适用于许多人类癌症循环肿瘤细胞的检测。但与其他方法药方向也有一定的作用。有研究发现［34-36］，当EGFR基因20相比，ISET法或许会漏检部分体积较小的肿瘤细胞，需要号外显子（T790M）突变时，对TKIs治疗有效的肿瘤即会发生对更多的细胞株和各种类型的肿瘤患者进一步研究以确定ISET应用的范围及大小阈值耐药，导致非小细胞肺癌患者病情进展。因此，CTCs不仅可［22］。

以评估治疗效果，制定个体化的治疗方案，甚至可以动态监1.4其他检测方法CTCs的数量在血液中处于极低水测肿瘤的耐药状态，进而分析肿瘤耐药机制。

平，被数十亿外周血细胞所掩盖，因此CTC检测技术需要2.3CTCs检查在肺癌靶向及免疫治疗中的应用迄今较高的敏感性，以捕获稀少的CTC，同时也需要较高特异性，

为以排除血液中正常细胞［23］

。检测方法必须是可重复、快速、经济、有效，并且可以进一步开展CTC的单细胞基因表型的HER2止在、PI3K非小、细ALK胞、肺ROS1癌中和发MET现的等靶点包括EGFR、BRAF、

［5，37］

。如今，在超过50%的肺癌患者肿瘤组织中都可以检测到特定的驱动基因作分析。

为治疗的靶点，包括KRAS、EGFR的点突变，FGFR1高表

达和ALK重组。NI等［38］

等通过Cellsearch系统检测了7个的循环肿瘤细胞原理开发了一种快速、ZHANG等［24］通过铁磁抗体可以筛选高表达c⁃MET无创、灵敏、特异的肺腺癌患者的循环肿瘤细胞，并进行全基因测序，该研究检测MET扩增型肿瘤细胞的方法。该方法对c⁃MET高表结果表明，在CTCs中检测到的单核酸变异（SNVs）都具有达细胞的敏感度100%高度特异性，提示EGFR、PIK3CA、TP53及RB1等突变基因CTCs。鉴于c⁃MET40%CTCs～80%与，MET对c⁃MET扩增的阴性细胞特异度相关性，c⁃MET都可以通过CTCs分析。因此，CTCs捕获联合单细胞测序技术可以有效的评估患者的治疗效果及早期监测肿瘤耐药个体化治疗的预测生物标志物，可能作为高表达cMET的胃癌、但需要进一步研究以确定结直肠癌和肾癌患者情况［39］，但CTCs中的基因突变能否能代表NSCLC原发灶其临床可靠性。MURLIDHAR等［25］报道了OncoBean芯片及转移灶的基因表型尚需要更多数据验证。

技术，它利用不同的剪切系数使CTC在高流率下通过不同的亲和性筛选出来，从乳腺癌、胰腺癌和肺癌患者的MENGCTCs等［40］等结合荧光原位杂交（Fish）技术检测乳腺癌患者中Her2致癌基因的扩增情况，他们发现通过血液标本中检测的结果发现该技术的检测CTC的平均效原发性肿瘤分析确定的Her2状态与他们的检测的CTCs之率>80%，其潜在的临床应用价值值得进一步研究。

间有不一致性。其他研究［41-42］2CTCs在NSCLC中的临床应用价值

CTCs通过IF和RT⁃PCR分析明最初及肿瘤组织上Her2阴性的患者可能在进展过程中发展为Her2基因同样证实了这一现象。这表Her2阳目前临床应用的血清肿瘤学标志物以及高分辨率的影性的CTCs，同样也可能证明了肿瘤的转移伴随者基因型像学（增强CT、PETCT或者MRI等）检查无法准确的预判肺的变化。

癌患者的进展、转移以及复发［26］目前，采用Cellsearch系统与ISETVR技术相结合的CTCNSCLC患者手术后亚临床病灶的情况，。而CTCs不仅可以反映分析作为非小细胞肺癌患者靶向治疗的预测性生物标志物液中的CTCs进行基因表型分析，为个体化治疗决策提供依还可以通过提取血的临床试验（如NCT02372448、NCT02827344、NCT0248）据［27］。

预计在2年内可能得出结论［43］。此外，有WANG等［44］利用

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晚期NSCLC患者中CTCs表面的PD⁃L1状态，作为免疫治

［9］DANILADC，HELLERG，GIGNACGA，etal.Circulating

疗的疗效预测指标。［43］

106tumortantprostatecellnumbercancer［andJ］.prognosisClinCancerinprogressiveRes，2007，castration⁃resis⁃13（23）：7053⁃检测出例NSCLCCTCs。在患者外周血中检测ILIE等等利用自动免疫染色法从71个可评价的样本中比较肿瘤活检组织CTCs，在80例（75%）患者与CTCs，发现CTCs的PD⁃L1状态与肿瘤组织中的PD⁃L1［10］7058.

COHENSJ，PUNTCJ，IANNOTTIN，etal.Relationshipof

状态一致，提示CTCs作为一种有效的液体活检方法有评circulatingtumorcellstotumorresponse，progression⁃freesur⁃

估晚期NSCLC免疫治疗的价值。

vival3结论

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在过去的20年中，循环肿瘤细胞在基础研究和临床

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，circulatingtumorcells［J］.Adv

应用方面均取得了不少成果，其异质性强、标本获取简便、BOLT⁃DEVJ，etal.Detectionof

无创伤及可重复性等优势越来越被人们认可，且CTCs对circulating肺癌诊断、CTCs预后评价、richmenttumorcellsinbreast］.BreastcancerCancermayimproveResTreatthrough，2011en⁃CTCs物理及生物特性个体化治疗有重要意义。如今基于的检测技术呈多样化发展，捕获127（1）：33⁃41.

withanti⁃CD146［J，

［13］ONSTENKW，KRAANJ，MOSTERTB，etal.Improvedcircu⁃

动基因相关研究，的效率越来越高，加快了从而促进了单细胞基因测序及驱CTCs应用于临床的进程。但是，lating目前循环肿瘤细胞检测仍无法取代组织活检在肺癌中金CellSearchtumor标准的地位，主要是检测时机及cutoff值的判定、技术方undergoingenrichmentcelldetectionapproachbyacombinedinpatientsEpCAMandMCAM］.MolwithCancerbreastcancer法的规范性、CTCs与原发肿瘤的生物学特征的一致性等2015，14（3）neoadjuvant：821⁃827.

chemotherapy［JTher，

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